Matar a un ruiseñor tiene lugar en Alabama durante la Depresión y está narrado por el personaje principal, una niña llamada Jean Louise «Scout» Finch. Su padre, Atticus Finch, es un abogado con altos estándares morales. Scout, su hermano Jem y su amigo Dill están intrigados por los rumores locales sobre un hombre llamado Boo Radley, que vive en su vecindario pero nunca sale de su casa. Cuenta la leyenda que una vez apuñaló a su padre en la pierna con un par de tijeras, y se le presenta como una especie de monstruo. Dill es de Mississippi pero pasa su verano en Maycomb en una casa cerca de Finch’s.
Los niños sienten curiosidad por saber más sobre Boo, y durante un verano crean un mini-drama que representan a diario, que cuenta los eventos de su vida tal como los conocen. Lentamente, los niños comienzan a acercarse a la casa de Radley, que se dice que está encantada. Intentan dejar notas para Boo en el alféizar de la ventana con una caña de pescar, pero Atticus los atrapa con firmeza por burlarse de la vida de un hombre triste. A continuación, los niños intentan acercarse sigilosamente a la casa por la noche y mirar por las ventanas. El hermano de Boo, Nathan Radley, que vive en la casa, cree que escucha a un merodeador y dispara su arma. Los niños huyen, pero Jem pierde sus pantalones en una cerca. Cuando regresa en medio de la noche para recuperarlos, han sido cuidadosamente doblados y el desgarro de la cerca cosido toscamente.
Otras cosas misteriosas les suceden a los niños Finch. Cierto árbol cerca de la casa Radley tiene un agujero en el que a menudo se les dejan pequeños obsequios, como monedas de un centavo, chicle y figuras talladas en jabón de un niño y una niña que tienen un parecido sorprendente con Scout y Jem. Los niños no saben de dónde vienen estos obsequios, y cuando van a dejar una nota para el misterioso dador, se encuentran con que el hermano de Boo ha tapado el agujero con cemento. El próximo invierno trae frío y nieve inesperados, y la casa de la señorita Maudie se incendia. Mientras Jem y Scout, temblando, miran las llamas desde cerca de la casa Radley, alguien pone una manta alrededor de Scout sin que ella se dé cuenta. Hasta que regresa a casa y Atticus le pregunta de dónde vino la manta, no se da cuenta de que Boo Radley debe haberla cubierto mientras estaba fascinada al ver a la señorita Maudie, su vecina favorita, y su casa en llamas.
Atticus decide tomar un caso que involucra a un hombre negro llamado Tom Robinson que ha sido acusado de violar a una niña blanca muy pobre llamada Mayella Ewell, miembro de la notoria familia Ewell, que pertenece a la capa de la sociedad Maycomb a la que la gente se refiere como «basura.» La familia Finch enfrenta duras críticas en el fuertemente racista Maycomb debido a la decisión de Atticus de defender a Tom. Pero Atticus insiste en seguir adelante con el caso porque su conciencia no le podía dejar hacer lo contrario. Sabe que Tom es inocente, y también que casi no tiene posibilidades de ser absuelto, porque el jurado blanco nunca creerá a un hombre negro antes que a una mujer blanca. A pesar de esto, Atticus quiere revelar la verdad a sus conciudadanos, exponer su intolerancia y animarlos a imaginar la posibilidad de la igualdad racial.
Debido a que Atticus está defendiendo a un hombre negro, Scout y Jem se encuentran susurrados y burlados, y tienen problemas para mantener los ánimos. En una reunión familiar de Navidad, Scout golpea a su empalagoso pariente Francis cuando acusa a Atticus de arruinar el apellido de la familia por ser un «amante de los negros». Jem corta las copas de los arbustos de flores de un viejo vecino después de que se burla de Atticus y, como castigo, tiene que leerle en voz alta todos los días. Jem no se da cuenta hasta después de su muerte que él la está ayudando a romper su adicción a la morfina. Al revelar esto a Jem y Scout, Atticus muestra a esta anciana como un ejemplo de verdadero coraje: la voluntad de seguir luchando incluso cuando sabes que no puedes ganar.
Se acerca el momento del juicio y la hermana de Atticus, Alexandra, viene para quedarse con la familia. Ella es apropiada y pasada de moda y quiere moldear a Scout en el modelo del ideal femenino sureño, para gran resentimiento de Scout. Dill se escapa de su casa, donde su madre y su nuevo padre no parecen interesados en él, y se queda en Maycomb durante el verano del juicio de Tom. La noche antes del juicio, trasladan a Tom a la cárcel del condado y Atticus, temiendo un posible linchamiento, hace guardia fuera de la puerta de la cárcel toda la noche. Jem está preocupado por él y los tres niños se escabullen a la ciudad para encontrarlo. Un grupo de hombres llega listo para causarle violencia a Tom y amenazar a Atticus en el proceso. Al principio, Jem, Scout y Dill se hacen a un lado, pero cuando siente el verdadero peligro, Scout sale corriendo y comienza a hablar con uno de los hombres, el padre de uno de sus compañeros de clase en la escuela. Su inocencia saca a la multitud de su mentalidad de mafia y se van.
El juicio enfrenta la evidencia de la familia blanca Ewell contra la evidencia de Tom. Según los Ewell, Mayella le pidió a Tom que le hiciera un trabajo mientras su padre estaba fuera, y Tom entró en su casa y golpeó y violó a la fuerza a Mayella hasta que apareció su padre y lo asustó. La versión de Tom es que Mayella lo invitó a entrar, luego lo abrazó y comenzó a besarlo. Tom intentó apartarla. Cuando llegó Bob Ewell, se enfureció y la golpeó, mientras Tom huía asustado. Según el testimonio del alguacil, los moretones de Mayella estaban en el lado derecho de su cara, lo que significa que lo más probable es que le hayan dado un puñetazo con la mano izquierda. El brazo izquierdo de Tom Robinson es inútil debido a un antiguo accidente, mientras que el Sr. Ewell lidera con el izquierdo. Dada la evidencia de una duda razonable, Tom debería quedar en libertad, pero después de horas de deliberación, el jurado lo declara culpable. Scout, Jem y Dill se cuelan en el juzgado para ver el juicio y se sientan en el balcón con la población negra de Maycomb. Están sorprendidos por el veredicto porque, para ellos, la evidencia estaba claramente a favor de Tom.
Aunque el veredicto es desafortunado, Atticus se siente satisfecho de que el jurado haya tardado tanto en decidir. Por lo general, la decisión se tomaría en minutos, porque no se confiaba en la palabra de un hombre negro. Atticus espera una apelación, pero lamentablemente Tom intenta escapar de su prisión y es asesinado a tiros en el proceso. Jem tiene problemas para manejar los resultados del juicio, sintiendo que su confianza en la bondad y la racionalidad de la humanidad ha sido traicionada.
Mientras tanto, el Sr. Ewell amenaza a Atticus y otras personas relacionadas con el juicio porque siente que fue humillado. Se vengó una noche mientras Jem y Scout caminan a casa después de la obra de Halloween en su escuela. Los sigue a casa en la oscuridad, luego corre hacia ellos e intenta matarlos con un gran cuchillo de cocina. Jem se rompe el brazo, y Scout, que lleva un traje de alambre en forma de jamón y no puede ver lo que está sucediendo, está indefenso durante todo el ataque. El escurridizo Boo Radley apuñala al Sr. Ewell y salva a los niños. Finalmente, Scout tiene la oportunidad de conocer al tímido y nervioso Boo. Al final de esta fatídica noche, el sheriff declara que el Sr. Ewell cayó sobre su propio cuchillo para que Boo, el héroe de la situación, no tenga que ser juzgado por asesinato. Scout lleva a Boo a casa e imagina cómo ha visto la ciudad y cómo las ha observado a ella, a Jem y a Dill a lo largo de los años desde el interior de su casa. Boo entra, cierra la puerta y nunca lo vuelve a ver.