El tema principal de la novela es el conflicto entre la civilización y la «vida natural». Huck representa la vida natural a través de su libertad de espÃritu, formas incivilizadas y deseo de escapar de la civilización. Fue criado sin reglas ni disciplina y tiene una fuerte resistencia a todo lo que pueda «sivilizarlo». Este conflicto se introduce en el primer capÃtulo gracias a los esfuerzos de la viuda Douglas: intenta obligar a Huck a ponerse ropa nueva, dejar de fumar y aprender la Biblia. A lo largo de la novela, Twain parece sugerir que la forma de vida incivilizada es más deseable y moralmente superior. Basándose en las ideas de Jean-Jacques Rousseau, Twain sugiere que la civilización corrompe, en lugar de mejorar, a los seres humanos.
El tema del honor impregna la novela después de ser introducido por primera vez en el segundo capÃtulo, donde Tom Sawyer expresa su creencia de que hay mucho honor asociado con el robo. El robo aparece a lo largo de la novela, especÃficamente cuando Huck y Jim se encuentran con ladrones en el barco naufragado y se ven obligados a soportar al Rey y al DelfÃn, quienes «roban» a todos los que encuentran. La banda de ladrones original de Tom tiene un paralelo más adelante en la novela cuando Tom y Huck se convierten en verdaderos ladrones, pero honorables, al final de la novela. Resuelven robar a Jim, liberándolo de los lazos de la esclavitud, lo cual es un acto honorable. Por lo tanto, el concepto de honor y actuar para ganarlo se convierte en un tema central en las aventuras de Huck.
La comida juega un papel destacado en la novela. En la infancia de Huck, a menudo pelea contra los cerdos por comida y come de «un barril de cosas extrañas». Por lo tanto, darle comida a Huck se convierte en un sÃmbolo de las personas que lo cuidan y protegen. Por ejemplo, en el primer capÃtulo, la viuda Douglas alimenta a Huck, y luego Jim se convierte en su cuidador simbólico, alimentándolo y cuidándolo en la isla de Jackson. La comida se vuelve a discutir de manera bastante prominente cuando Huck vive con los Grangerford y los Wilks.
Un tema en el que Twain se centra bastante en esta novela es la burla a la religión. A lo largo de su vida, Twain fue conocido por sus ataques a la religión organizada. El carácter sarcástico de Huck Finn lo sitúa perfectamente para burlarse de la religión, representando los puntos de vista personales de Twain. En el primer capÃtulo, Huck indica que el infierno suena mucho más divertido que el cielo. Posteriormente, en una escena muy destacada, el «Rey», mentiroso y tramposo, convence a una comunidad religiosa de que le dé dinero para que «convierta» a sus amigos piratas. Las personas religiosas se extravÃan fácilmente, lo que se burla de sus creencias y devoción a Dios.
La superstición aparece a lo largo de la novela. En general, tanto Huck como Jim son personajes muy racionales, sin embargo, cuando se encuentran con algo un poco supersticioso, la irracionalidad se impone. La superstición del poder sobre los dos demuestra que Huck y Jim son como niños a pesar de su aparente madurez. Además, la superstición presagia la trama en varios cruces clave. Por ejemplo, cuando Huck derrama sal, Pap regresa, y cuando Huck toca una piel de serpiente con sus propias manos, una serpiente de cascabel muerde a Jim.
El tema de la esclavitud es quizás el aspecto más conocido de esta novela. Desde su primera publicación, la perspectiva de Twain sobre la esclavitud y las ideas que rodean el racismo han sido objeto de acalorados debates. En su vida personal y pública, Twain fue vehementemente contra la esclavitud. Teniendo en cuenta esta información, es fácil ver que Las aventuras de Huckleberry Finn proporciona una alegorÃa para explicar cómo y por qué la esclavitud está mal. Twain usa a Jim, un personaje principal y un esclavo, para demostrar la humanidad de los esclavos. Jim expresa las complicadas emociones humanas y lucha con el camino de su vida. Para evitar ser vendido y obligado a separarse de su familia, Jim huye de su dueña, la señorita Watson, y trabaja para obtener la libertad para poder comprar la libertad de su familia. A lo largo de su viaje rÃo abajo, Jim cuida y protege a Huck, no como un sirviente, sino como un amigo. Por lo tanto, Twain anima al lector a sentir simpatÃa y empatÃa por Jim y a indignación por la sociedad que lo esclavizó y amenazó su vida. Sin embargo, aunque Twain ataca la esclavitud a través de su interpretación de Jim, nunca aborda directamente el tema. Huck y Jim nunca debaten sobre la esclavitud, y todos los demás esclavos de la novela son personajes muy secundarios. Solo en la sección final de la novela Twain desarrolla el conflicto central sobre la esclavitud: ¿deberÃa Huck liberar a Jim y luego ser condenado al infierno? Esta decisión cambia la vida de Huck, ya que lo obliga a rechazar todo lo que la «civilización» le ha enseñado. Huck elige liberar a Jim, basándose en sus experiencias personales más que en las normas sociales, eligiendo asà la moralidad de la «vida natural» sobre la de la civilización.
El concepto de riqueza o falta de ella está entretejido a lo largo de la novela y destaca la disparidad entre ricos y pobres. Twain comienza deliberadamente la novela señalando que Huck tiene más de seis mil dólares a su nombre; una suma de dinero que eclipsa todas las demás sumas mencionadas, lo que las hace parecer intrascendentes en contraste. Huck demuestra una actitud relajada hacia la riqueza y, debido a que tiene mucha de ella, no ve el dinero como una necesidad, sino más bien como un lujo. Las opiniones de Huck sobre la riqueza contrastan claramente con las de Jim. Para Jim, que busca sacar a su familia de la esclavitud, el dinero es equivalente a la libertad. Además, la riqueza le permitirÃa elevar su estatus en la sociedad. Por lo tanto, Jim está en una búsqueda constante de riqueza, mientras que Huck permanece apático.
La mayor parte de la parcela se desarrolla a orillas del rÃo. Para Huck y Jim, el rÃo representa la libertad. En la balsa, son completamente independientes y determinan sus propios cursos de acción. Jim espera con ansias llegar a los estados libres, y Huck está ansioso por escapar de su padre abusivo y borracho y de la «civilización» de la señorita Watson. Sin embargo, los pueblos a lo largo de la orilla del rÃo comienzan a ejercer influencia sobre ellos y, finalmente, Huck y Jim se encuentran con criminales, naufragios, deshonestidad y un gran peligro. Finalmente, una neblina les obliga a perder la ciudad de El Cairo, momento en el que planeaban remontar el rÃo Ohio, hacia los estados libres, en un barco de vapor.
Originalmente, el rÃo es un lugar seguro para los dos viajeros, pero se vuelve cada vez más peligroso a medida que las realidades de sus vidas fugitivas se apoderan de Huck y Jim. Una vez que refleja la libertad absoluta, el rÃo pronto se convierte en un escape a corto plazo, y la novela concluye sobre la seguridad de la tierra firme, donde, irónicamente, Huck y Jim encuentran su verdadera libertad.