George Milton. Un trabajador migrante que viaja de una granja a otra con su amigo Lennie, con discapacidad mental, durante la Depresión. Los dos sueñan con ganar suficiente dinero para comprar una pequeña granja donde Lennie pueda cuidar conejos. En virtud de su superioridad mental, George asume un papel dominante con Lennie, actuando como padre. Debido a que Lennie tiende a involucrar a George en situaciones difíciles, George debe ser responsable, sensato y estar listo para lidiar con cualquier tragedia que pueda surgir. A pesar de los muchos problemas que Lennie le causa a George, él se queda con su simple amigo como un buffet contra la soledad y conserva una esperanza palpable de que los dos eventualmente dejarán la vida sin rumbo de un trabajador migrante para vivir una existencia más plena.
Lennie Small. Lennie, un hombre gigantesco y mentalmente discapacitado, es simplista y dócil. Él se obsesiona con los placeres sensoriales simples, particularmente encontrando gran alegría al tocar cosas suaves, ya sea un vestido de algodón o un cachorro suave. Aunque Lennie es inherentemente inocente, todavía es capaz de una gran violencia, ya que carece de la capacidad de controlarse físicamente y tiene un gran instinto protector, especialmente cuando se trata de su amigo, George. Lennie sueña con George con tener un pequeño terreno; está obsesionado con un aspecto de este sueño: tener una pequeña conejera donde pueda cuidar conejos. Lennie es incapaz de tomar decisiones por sí mismo y confía completamente en George.
Un hombre anciano y lisiado que ha perdido su mano, Candy es el patinador del rancho. Sigue apegado a su perro envejecido, que se ha vuelto tan débil y enfermizo que depende completamente de Candy para sobrevivir. Aún así, cuando Carlson se opone al olor del perro, Candy le permite a Carlson sacar al perro de su miseria. Candy es un hombre pasivo, incapaz de emprender ninguna acción independiente. De hecho, su único acto importante en el libro, cuando ofrece dinero a Lennie y George para comprar un terreno con ellos, es un medio por el cual puede volverse dependiente de ellos.
Hijo del dueño del rancho, Curley es un hombre de baja estatura que, sin embargo, es un boxeador formidable. Curley es agresivo, jactancioso y engreído, con un temperamento volátil y una tendencia a provocar conflictos con los débiles, como lo hace con Lennie. Parte de la bravuconería de Curley proviene de la ansiedad por su nueva esposa, de quien todos sospechan que es «una vagabunda». Pasa mucho tiempo vigilándola, creyendo que se va con otros hombres cuando no está bajo su supervisión.
Generalmente considerado como un vagabundo por los hombres en el rancho, la esposa de Curley es el único personaje importante en De ratones y hombres a quien Steinbeck no le da un nombre. No le gusta su marido y se siente desesperadamente sola en el rancho, porque es la única mujer y se siente aislada de los otros hombres, que la desprecian abiertamente. Todavía tiene una pequeña esperanza de una vida mejor, afirmando que tuvo la oportunidad de convertirse en una estrella de cine en Hollywood, pero por lo demás es una mujer amargada y desdeñosa que usa el sexo para intimidar a los trabajadores. Lennie la asesina accidentalmente.
Crooks, el macho del establo del rancho, es también el único hombre negro de la novela. Un hombre orgulloso y amargado, Crooks tiene una inteligencia cínica y un comportamiento despectivo que usa para evitar que otros lo excluyan inevitablemente debido a su raza. Sin embargo, su actitud defensiva se desvanece una vez que Lennie se comporta amablemente con él, e incluso considera ayudar a Lennie y Candy con su plan para comprar tierras hasta que las amenazas de la esposa de Curley lo obligan a volver a su postura combativa normal.
Carlson, un hombre corpulento que trabaja en el rancho, se queja del perro de Candy y finalmente se ofrece a sacar al perro de su miseria. George roba el arma de Carlson para dispararle a Lennie después de que asesinan a la esposa de Curley.
Slim, el desollador jerkline del rancho, es un hombre aparentemente sin edad que se comporta con gran seriedad. Le da a Lennie uno de su nueva camada de cachorros para que cuide. Curley inicialmente sospecha que su esposa está teniendo una aventura con Slim.
Es uno de los trabajadores del rancho, un joven que le muestra a Carlson la revista con la carta de William Tenner.
El jefe del rancho es el padre de Curley. Actúa sospechosamente con George y Lennie cuando llegan, pensando que hay algo extraño en los dos compañeros que no coinciden.
La mujer que crió a Lennie. Aunque fallecida, se le aparece a Lennie en una alucinación cuando él se esconde en la maleza en el Capítulo Seis. En esta alucinación, aparece como una mujer baja pero robusta que reprende a Lennie por su estupidez.
Whit, un ex trabajador del rancho que conducía un cultivador, le muestra a Carlson una revista que tiene una carta para el editor que Bill Tenner ha escrito.
Un conocido de la escuela primaria, George le dice a Lennie que ahora está en la cárcel de San Quentin «?? a causa de una tarta».
El alguacil adjunto de Soledad. Curley envía a Whit a buscarlo cuando asesinan a su esposa.
